PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS IgY ANTI-P21 RECOMBINANTE DE TRYPANOSOMA CRUZI

Resumo

Os objetivos deste trabalho foram: (i) produzir anticorpos policlonais IgY contra a versão recombinante da proteína de invasão celular P21 (P21r) de Trypanosoma cruzi; (ii) purificar os anticorpos IgY totais da gema do ovo de galinhas imunizadas com P21r; (iii) avaliar a qualidade dos procedimentos de purificação. Para a produção dos anticorpos IgY, três galinhas da linhagem HySex (25 semanas de idade), foram imunizadas com 100µg de P21r /250 µl de PBS (pH 7,2) emulsionado em 250 µl de adjuvante completo (primeira imunização) e incompleto (segunda e terceira imunizações) de Freund. Realizaram-se três imunizações, intramusculares, com intervalo de 14 dias. O volume final (500 µl) foi inoculado em quatro locais do músculo peitoral. Os ovos foram colhidos diariamente, durante sete semanas. As gemas foram armazenadas a -20ºC. Para a purificação, a fração solúvel em água (FSA) foi obtida da gema total, por meio de precipitação em água acidificada (pH 5,0-5,2), seguida de salting-out da FSA com sulfato de sódio (19% e 14%). A extração dos anticorpos IgY foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12% e pelo teste de dot-blot com anticorpos anti-IgY marcados com peroxidase. A água acidificada produziu um sobrenadante translucido (FSA) e um precipitado denso de cor amarela (P1, precipitado 1). O salting-out da FSA resultou em um precipitado de cor branca (P2, precipitado 2). O SDS-PAGE demonstrou a progressiva remoção de contaminantes, a cada etapa da extração. No SDS-PAGE a fração P2 apresentou uma banda proteica de peso molecular estimado de 180 kDa. No dot-blot foi feita a detecção de anticorpos IgY na fração P2. Utilizando procedimentos de fácil execução é produzida uma fração enriquecida em anticorpos IgY com grande potencial de emprego nos estudos celulares envolvendo o papel da P21 na interação parasita-hospedeiro. PALAVRAS-CHAVE: IMUNOGLOBULINAS. TRIPANOSSOMATÍDEOS. PROTEÔMICA. AGRADECIMENTO: CNPq e Instituto de Estudos Avançados em Medicina Veterinária José Caetano Borges. ÁREA TEMÁTICA: Doenças Parasitárias