ANÁLISE IN SILICO DE INICIADORES ESPECÍFICOS PARA CRYPTOSPORIDIUM BAILEYI / IN SILICO ANALYSIS OF SPECIFIC PRIMERS OF CRYPTOSPORIDIUM BAILEYI - GARCIA, M. H.; SOARES, B. A.; BARÇANTE, J. M. P.; PECONICK, A. P. (Ars Veterinaria, 2013)
A criptosporidiose aviária é uma doença de relevância devido à capacidade de produzir doença respiratória e/ou gastrointestinal, altos índices de morbidade e mortalidade. Utilizando métodos moleculares, as amostras isoladas de animais ou do ambiente podem ser caracterizadas ampliando o conhecimento da distribuição e biologia desses parasitos. A técnica de PCR é uma ferramenta útil para a identificação das espécies de Cryptosporidium. A utilização de bons iniciadores é fundamental para o sucesso da técnica. Neste estudo objetivou-se realizar uma análise in silico de primers para Cryptosporidium baileyi utilizando o software OligoAnalyser 3.1. Foram selecionados cinco genes de C. baileyi e desenhados cinco pares de iniciadores (forward/reverse) para cada gene. A análise in silico foi realizada baseada na avaliação da temperatura de anelamento, na proporção CG, no tamanho do iniciador e na similaridade com C. baileyi e no distanciamento genético comparado a outras espécies de Cryptosporidium e a outras espécies passíveis de serem encontradas nas fezes de frango ou em amostras de água ambiental. Dos 25 pares de iniciadores analisados, verificou-se que 23 apresentaram padrões qualitativos satisfatórios. Dois iniciadores foram considerados inadequados devidos à alta concentração de CG. Vinte e três iniciadores apresentaram similaridade superior a 95% com outras espécies de Cryptosporidium. Dois pares de iniciadores apresentaram similaridade de 100% com C. bayleyi, mas similaridade em torno de 85% com outras espécies do gênero. O desenho de iniciadores para PCR é o passo chave para uma reação bem sucedida, sendo um procedimento simples quando a seqüência do DNA alvo a ser amplificada é conhecida. No presente trabalho verificou-se que a ausência de um seqüenciamento completo para C. baileyi dificultou a seleção bons iniciadores, resultando em alta identidade com outras sequências gênicas. Diante destes resultados conclui-se que há a necessidade de continuar as análises in silico a fim de obter um conjunto de iniciadores com grande probabilidade de serem eficazes. SUMMARY Cryptosporidiosis influenza is a relevant disease due to the ability to cause respiratory and/or gastrointestinal diseases, with high morbidity and mortality rates. Samples isolated from animals or the environment can be characterized using molecular methods, broadening the knowledge about the distribution and biology of these parasites. The PCR technique is a useful tool to identify Cryptosporidium species. The use of good primers is critical to the success of the technique. This study aimed at performing in silico analysis of primers for Cryptosporidium baileyi identification using the OligoAnalyser 3.1 software. We selected five genes of C. baileyi and designed five primer pairs (forward/reverse) for each gene. In silico analysis was performed based on the evaluation of the annealing temperature, the GC ratio, initiator size, similarity with C. baileyi and genetic distancing compared to other species of Cryptosporidium and other species that can be found in chicken droppings or environmental water samples. Of the 25 primer pairs tested, 23 were found to have satisfactory quality standards. Two primers were considered inadequate due to high GC concentration. Twenty-three primers showed similarity greater than 95% with other species of Cryptosporidium. Two pairs of primers showed 100% similarity with C. bayleyi, but similarity around 85 % with other species of the genus. The design of primers for PCR is the key step for a successful reaction, being a simple procedure when the sequence of the target DNA to be amplified is known. In the present work it was found that the lack of complete C. baileyi sequencing makes it difficult to select good initiators, resulting in high identity with other gene sequences. Given these results it is concluded that it is necessary to continue the in silico analysis to obtain a set of primers with high probability of being effective.