DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA DE SEMI-NESTED-RT-PCR PARA A DETECÇÃO DO VIRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE EM POMBOS CAPTURADOS EM JABOTICABAL-SP, BRASIL / DEVELOPMENT OF SEMI-NESTED-RT-PCR TECHNIQUE FOR THE DETECTION OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS IN PIGEONS ...

E. S. OLIVEIRA, F. S. FERNANDO, K. R. SILVA, R. M. SANTOS, M. F. S. MONTASSIER, H. J. MONTASSIER

Resumo


O vírus da doença de Newcastle (VDN) é o agente causador de uma das mais importantes doenças de aves domésticas e silvestres e representa uma ameaça para a avicultura. Os pombos (Columba livia) são susceptíveis ao VDN, sendo considerados disseminadores em potencial desse vírus e por esse motivo tem um importante papel na cadeia epidemiológica dessa enfermidade que é capaz de causar impactos econômicos negativos para a indústria avícola. Este estudo teve por objetivo investigar a presença do VDN em suabes cloacais de 101 pombos capturados em Jaboticabal-SP, com base na técnica molecular Semi-nested-RT-PCR, tendo como alvo a amplificação da região codificadora da proteína de Fusão de 196 pb.  Foram avaliadas quatro combinações de primers externos com os internos na técnica de Semi-Nested-RT-PCR, testando-as em diluições seriadas de amostras de líquido córion-alantóide (LCA) infectado com a estirpe LaSota do VDN. Escolhendo-se a combinação de primers externos e internos que revelou uma maior sensibilidade analítica para ser aplicada na análise dos suabes cloacais de pombos.  Os resultados mostraram que a melhor combinação de primers externos e internos apresentou um limiar de detecção na Semi-Nested-RT-PCR até a diluição 10-10 da suspensão de LCA com VDN. A especificidade analítica dos primers foi também avaliada utilizando-se suspensões de LCA infectadas com quatro vírus heterólogos ao VDN, dos quais nenhum produto amplificado foi gerado. Os resultados obtidos mostraram que das 101 amostras de suabes cloacais de pombos analisadas, 9 (8,9%) foram positivas para a presença do VDN. Concluindo, a técnica de Semi – nested – RT - PCR desenvolvida nesse estudo mostrou-se eficiente na detecção específica e com elevada sensibilidade do VDN, tanto em amostras de LCA como de suabes cloacais de pombos, indicando o seu grande potencial de aplicação no diagnóstico direto do VDN em diferentes tipos de amostras biológicas provenientes de aves.

 

 

SUMMARY

 

 The Newcastle disease virus (NDV) is the causative agent of an important disease of domestic and wild birds and poses a threat to the poultry industry. Pigeons (Columba livia) are susceptible to NDV and considered potential spreaders of the virus. Therefore, pigeons have an important role in the epidemiology of this disease that can impact negatively the poultry industry. This study aimed to investigate the presence of NDV on cloacal swabs of 101 pigeons captured in Jaboticabal. The molecular technique is based on semi-nested RT-PCR and targets the amplification of the coding region of the Fusion protein 196 bp. We assessed four combinations of external and internal primers in the semi-nested RT-PCR technique by testing serial dilutions of the samples in chorion-allantoic fluid (CAF) infected with LaSota strain of NDV. The combination of external and internal primers that yielded higher analytical sensitivity was used in the analysis of cloacal swabs of pigeons. The results showed that the best combination of external and internal primers presented a detection threshold in semi-nested RT-PCR up to 10-10 dilution of the CAF with NDV suspension. The analytical specificity of the primers was also evaluated using CAF suspensions infected with four viruses heterologous to the NDV, of which no amplified product was generated. The results showed that of 101 samples of pigeon cloacal swabs analyzed, 9 (8.9%) were positive for NDV. In conclusion, the semi-nested RT- PCR technique developed in this study was efficient for specific detection with high sensitivity to NDV in both samples, CAF and pigeon cloacal swabs, indicating its great potential for application in direct diagnosis of NDV in different types of biological samples from poultry.

 



Texto completo:

PDF - RESUMO PDF - SUMMARY


DOI: http://dx.doi.org/10.15361/2175-0106.2013v29n4p11