O PROCESSO DE PROPAGAÇÃO DE Ehrlichia canis EM MACRÓFAGOS É DEPENDENTE DO CITOESQUELETO DE ACTINA E DO INFLUXO DE CÁLCIO E FERRO / THE SPREADING PROCESS OF Ehrlichia canis IN MACROPHAGES IS DEPENDENT ON ACTIN CYTOSKELETON AND IRON AND CALCIUM INFLUX

Resumo

Erliquioses são enfermidades de importância médica e veterinária, causadas por α-proteobactéria Gram-negativa pertencente à ordem Rickettsiales. No Brasil, o principal agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é a Ehrlichia canis, patógeno intracelular obrigatório com tropismo para monócitos e macrófagos. Este microrganismo tem ampla distribuição mundial, mais comumente encontrada em regiões tropicais e subtropicais devido à distribuição geográfica de sua principal vetor, o carrapato Rhipicephalus sanguineus. O processo de invasão já descrito para algumas bactérias deste gênero, tais como E. muris e E. chaffeensis,  compreende quatro fases: adesão, internalização, proliferação intracelular e propagação intercelular. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares envolvidos no processo de invasão nas células-alvo por parte da Ehrlichia canis. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o papel do citoesqueleto de actina, do cálcio e do ferro durante o processo de propagação de E. canis, cepa São Paulo, em macrófagos caninos (DH82), in vitro. Para cada um desses componentes celulares foram utilizadas diferentes drogas inibitórias: citocalasina D (inibe a polimerização dos filamentos de actina); verapamil (bloqueador de canais de cálcio), ambas incubadas por 3h; e deferoxamina (quelante de ferro), incubadas por 24h. Após o tempo de incubação de cada droga, as células infectadas foram lavadas e mantidas em cultura por quatro dias, em estufa de CO₂ a 5% e 37^oC. Após esse tempo, análises semi-quantitativas já descritas, baseadas no tamanho das mórulas, foram realizadas a fim de determinar a taxa de infectividade das células infectadas tratadas em relação às células infectadas e não tratadas. Considerou-se significante valores de p<0.05 (unpaired 2-tailed Student's t-test). Os resultados demonstraram uma diminuição significativa no número total de bactérias nas células infectadas tratadas com todas as drogas em relação ao controle, sugerindo que estes componentes celulares analisados são essenciais à propagação de Ehrlichia canis em macrófagos in vitro. A elucidação da importância desses mecanismos celulares na propagação da bactéria sob estudo serve de base para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

SUMMARY

Erliquioses are diseases of medical and veterinary importance, caused by a Gram-negative α-proteobacteria that belongs to the order Rickettsiales. In Brazil, the main causative agent of canine monocytic ehrlichiosis (CME) is Ehrlichia canis, obligate intracellular pathogen with tropism for monocytes and macrophages. This worldwide distributed microorganism is most commonly found in tropical and subtropical regions due to the geographical distribution of its main vector, the tick Rhipicephalus sanguineus. The invasion process already described for some bacteria of this genus, such as E. muris and E. chaffeensis, comprises four stages: adhesion, internalization, intracellular proliferation and intercellular propagation. However, little is known about the cellular mechanisms involved in the invasion process of the target cells by Ehrlichia canis. The objective of this study was to analyze the role of actin cytoskeleton, calcium and iron on the spreading process of E. Canis, São Paulo strain, in canine macrophage (DH82), in vitro. For each of these cellular components, different inhibitory drugs were used: cytochalasin D (inhibits the polymerisation of actin filaments), verapamil (a calcium channel blocker), both incubated for 3h, and deferoxamine (chelating iron), incubated for 24 hours. After the incubation time of each drug, the infected cells were washed and maintained in culture for four days in 5% CO₂ incubator at 37°C. After this time, semi-quantitative analyses already described, based on the size of morulae were performed to determine the rate of infectivity of treated infected cells, compared to untreated. The results were considered significant if p​​<0.05 (unpaired 2-tailed Student's t –test). The results showed a significant decrease in the total number of bacteria in infected cells treated with all drugs compared to control, suggesting that these components are essential elements for cell propagation of Ehrlichia canis in macrophages in vitro. The elucidation of these important mechanisms in cell propagation of the bacteria under study is the basis for the development of new therapeutic strategies.